真菌线粒体DNA快速提取试剂盒(离心柱)

Fungus Mitochondrial DNA Extraction Kit（Spin Colunm）

真菌线粒体DNA快速提取试剂盒(离心柱)

 【产品简介】

   线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。本试剂盒提供了一套方便的工具从各种细胞和组织中提取MTDNA，产量高，纯度好，不污染基因组DNA。纯化的MTDNA可用于多种研究，比如酶处理分析、Southern blotting、克隆、PCR分析以及扩增等。

【试剂盒组成】

【试剂运输及储存条件】

试剂运输可在室温环境下进行。储存时，溶液MTA加入RNase A后须置4℃保存，溶液MTC可置4℃保存，其余组分可保存在室温。

【自备实验器材】

试剂类：异丙醇、无核酸酶水。

耗材类：经无核酸酶水处理并高压灭菌（121℃，30分钟）的2ml和1.5ml离心管及10μl、200μl、1000μl吸嘴、一次性手套、口罩。

设备类：电动匀浆机、各种规格的移液器、低温和常温台式离心机、震荡仪、研钵，手术刀，金属镊，水浴锅，冰盒。

【操作步骤】

1.       取适量真菌菌丝（200-500mg）用电子天平称量，放入液氮中研磨至粉末状。然后立即将该组织转移至加有600μl裂解液PLB的无核酸酶的离心管中，如仍有块状物质，用电动匀浆机在冰浴中匀浆组织约15s直到看不见明显的组织块。

注意: 处理标本前可以先往PLB中加入1-4%巯基乙醇。

2.       用移液器吸打混匀，65℃水浴30min，每隔10 min上下轻轻颠倒混匀。

3.       将上清液于4℃，14000xg低温离心30min。

4.       弃上清，得到线粒体沉淀。往沉淀中加入150μl预冷的溶液MTA，用移液器吹散混匀沉淀。

注意：请确认是否已经往溶液MTA中加入RNase A。

5.       将裂解物于37℃温水浴 1hr 以彻底除去RNA。

6.       往裂解物中加入300μl溶液MTB，轻柔颠倒离心管10次混匀，至于冰浴变性7min。

7.       加入225μl溶液MTC，轻柔颠倒离心管10次混匀，至于冰浴复性30min。

8.       4℃，12000xg低温离心6min。

9.       小心吸取上清至一新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，用移液器吸打混匀。

10.   立即吸取700μl样品以及有可能形成的沉淀，加入带有2ml收集管的离心纯化柱。轻盖盖子，11,000 x g，室温离心15s，弃尽废液。

11.   将剩余的样品转移至离心柱，重复第10步。

12.   往离心柱中加入500μl漂洗液WB，轻盖盖子，11,000 x g，室温离心15s，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否已经往WB 中加入适量无水乙醇。

13.   重复第12步，用500μl 漂洗液WB再次洗涤离心柱，最后一次洗涤后，11,000 x g离心空柱1min干燥硅胶膜。

注意：完全去除洗液对最后溶解是非常重要的，洗液的残留会影响最终的洗脱。

14.   将离心柱转移至一新的无RNA酶的1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加60μl无核酸酶水，轻盖管盖，室温静置1min，11,000 x g 离心1min洗脱RNA。

注意：洗脱体积不宜小于50μl，否则会影响洗脱效果。

15.   把洗脱液滴加回硅胶膜重复第14步洗脱。

16.   如需后续操作，请始终将溶解的DNA至于冰上，保存请置于-80℃。

注意：为增加DNA的得率，洗脱液体积不应少于50μl，体积过小会影响回收效率，洗脱液的pH值也对洗脱效率有很大影响，若用ddH₂O洗脱液应保证pH 7.0-8.5范围内，pH低于7.0会影响洗脱效率；DNA需置于-20℃保存，以防止DNA降解。

【注意事项】

1. 操作时请使用一次性手套和口罩。

2. 第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB中加入适量乙醇。

3. 为增加洗脱效果，可将洗脱液EB于65℃水浴加热后使用。

【有效期】

本试剂盒有效期为12个月，请在有效期内使用。

注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。