细菌基因组DNA提取试剂盒

Bacteria Genomic DNA Extraction Kit

细菌基因组DNA提取试剂盒

 【产品简介】

   本试剂盒的抽提试剂采用独特的配方和添加剂，可从各种革兰氏阴性、阳性细菌中快速提取到高质量的基因组DNA，还可以有效地抑制各种外源性和内源性的核酸酶，同时结合特制的纯化柱，能最大限度的保持核酸的完整性、高得率以及纯度。

【试剂盒组成】

注意：使用前请在按照标签提示漂洗液WB1、WB2中加入适量无水乙醇。如不立即使用，RNAase，蛋白酶K置于-20℃保存。

【试剂运输及储存条件】

本试剂盒置于室温（15-25℃）可保存；更长时间的保存可置于2-8℃。在2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。

【自备实验器材】

试剂类：无水乙醇，异丙醇，溶菌酶(用于革兰氏阳性菌破壁处理)。

耗材类：经DEPC水处理并高压灭菌（121℃，30分钟）的2ml和1.5ml离心管、10ml、200ml、1000ml吸嘴、一次性手套及口罩。

设备类：电动匀浆机、各种规格的移液器、低温和常温台式离心机、震荡仪、研钵，手术刀，金属镊子。

【操作步骤】

1.       将3-5ml菌液室温10,000rpm离心1min浓缩收集，直至将全部的菌沉淀收集。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180 μl缓冲液(20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton；终浓度为20 mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37 ℃处理30 min以上。

2.       加入200μl缓冲液PDB，用移液器吸打混匀菌沉淀。

3.       加入20μl 蛋白酶K，56℃温水浴30min，然后置于70℃水浴10min。

4.       加入10μl RNase A，用移液器吸打混匀，室温放置5-10 min。

5.       加入600μl裂解液LB和80μl缓冲液BEH，用移液器吸打混匀，室温静置5min。

6.       加入530μl预冷的异丙醇，轻柔颠倒数次直至彻底混匀。

7.       吸取700μl裂解物以及有可能形成的沉淀至纯化柱，室温11,000rpm离心15s。

8.       弃尽流穿液，重复步骤7，直至将剩余样品全部通过纯化柱。

9.       往纯化柱内加入700μl漂洗液WB1，室温11,000rpm离心15s，反复操作，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否按标签提示往漂洗液WB1中加入适量无水乙醇。

10.   往离心柱中加入500μl漂洗液WB2，11,000xg , 室温离心15s，反复操作，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否按标签提示往漂洗液WB2中加入适量无水乙醇。

11.   往离心管中加入500μl漂洗液WB2，11,000xg , 室温离心15s，反复操作，弃尽废液。

12.   室温11,000rpm离心空柱1min干燥硅胶模。

13.   往膜中央滴加50μl 65℃预热的洗脱液EB，室温放置3min，室温11,000rpm离心1min，收集DNA。

14.   把洗脱液滴加回硅胶膜重复第13步洗脱。

15.   如需后续操作，请始终将溶解的DNA至于冰上，保存请置于-80℃

注意：为增加基因组DNA的得率，洗脱液体积不应少于50μl，体积过小会影响回收效率，洗脱液的pH值也对洗脱效率有很大影响，若用ddH₂O洗脱液应保证pH 7.0-8.5范围内，pH低于7.0会影响洗脱效率；DNA需置于-20℃保存，以防止DNA降解。

【DNA定量】

实例：用常规比色皿测量RNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（10μl DNA样品+990μl无核酸酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在1ml比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

实例：用超微量比色皿测量DNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（1 μl DNA样品+99 μl无核酸酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在超微比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

【注意事项】

1. 操作时请使用一次性手套和口罩。

2. 第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB1、WB2中加入适量乙醇。

3. 为增加裂解效果，可在裂解液LB中加入终浓度为0.1%的巯基乙醇，但加入巯基乙醇后，会降低裂解液LB的稳定性，推荐现用现加。

【有效期】

本试剂盒有效期为12个月，请在有效期内使用。

注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。