Two Step qRT-PCR Kit (SYBR Green)
产品分类： 定量PCR相关制品
主要产品有：Two Step Real-Time PCR Kit (SYBR Green)）是专为两步法荧光定量PCR实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR 反应系统，可以从极低量的总RNA 或poly(A)+ RNA 合成第一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
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产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品价格 |
LK-0113A | Two Step qRT-PCR Kit (SYBR Green) | 50次 | 600.00元 |
LK-0113B | 100次 | 1080.00元 |
【产品简介】
Two Step Real-Time PCR Kit (SYBR Green)）是专为两步法荧光定量PCR实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR 反应系统，可以从极低量的总RNA 或poly(A)+ RNA 合成第一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
【注意】
1.用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2.RNA样品要避免基因组DNA污染。
3.避免多次反复冻融RNA。
4.试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5.cDNA产物应置于-20℃保存
【试剂盒组成】
A：反转录反应部分
试剂盒组成 | LK-0113A (20ml×50次) | LK-0113B (20ml×100次) |
RT Master Mix(2×) | 500μl×1支 | 1ml×1支 |
RT Enzyme Mix | 50μl×1支 | 100μl×1支 |
oligo (dT)15(20μM) | 50μl×1支 | 100μl×1支 |
Random (20μM) | 50μl×1支 | 100μl×1支 |
RNase Free ddH2O | 1ml×1支 | 1ml×1支 |
说明书 | 1份 | 1份 |
B：PCR 反应部分
试剂盒组成 | 20μl×50次 | 20μl×100次 |
PCR Master Mix(2×) | 0.5ml×1支 | 1ml×1支 |
PCR Enzyme Mix | 50µl×1支 | 100µl×1支 |
RNase Free ddH2O | 1ml×1支 | 1ml×2支 |
说明书 | 1份 | 1份 |
【试剂运输及储存条件】
试剂盒运输可在2-8℃环境下进行。储存时，须置-20℃避光保存。有效期为12个月，请在有效期内使用。
【适用荧光PCR仪器】
以下机型需要另购Rox Reference Dye(25mM)货号： LK-0114。
注意：ABI Prism7500，ABI Prism7500 Fast, MJ Research Chromo4，Corbett Rotor Gene 3000机型，添加ROX Reference Dyev 0.4µl/反应（0.1X）。
ABI Prism7000/7300/7700/7900 , Eppendorf , ABI Step One, ABI Step One Plus机型，添加ROX Reference DyeI 0.4µl/反应(1X)。
【操作步骤】
注意：下列操作步骤适用于模板量为50ng-2μg的总RNA，如果总RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
1. 将模板RNA完全融化并至于冰浴中，将特异性引物、RT Master Mix、RT Enzyme Mix、Standard Dilution 、oligo (dT)15、Random、RNase Free ddH2O溶解后，稍微震荡混匀，离心后置于冰浴中。
2. PCR试剂准备：在冰浴条件下按下表配制反应液
反应成分 | 体积/反应 | 终浓度 |
RT Master Mix(2×) | 10ml | 1× |
RT Enzyme Mix | 1ml | |
oligo (dT)15或Random(20μM) | 1ml | 1mM |
或特异性引物(1μM) | 1.2ml | 60nM |
RNA模板 | 5-8ml | |
RNase Free ddH2O | 补水至20μl |
注意：当同时需要进行多次RT反应时，将各组分加倍混合后再分装到每个反应管中，可以减少实验操作产生的误差，使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失。
3. 逆转录反应（在扩增检测区进行）
循环参数设定：（请参照各类仪器的操作软件进行设置）
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
1 | 反转录反应 | 42-50℃ | 30-45分钟 | 1 |
2 | 预变性 | 85℃ | 10分钟 | 1 |
注意：RT后的cDNA如需要进行稀释后的梯度试验，可以用试剂盒中的Standard Dilution进行稀释，也可以用RNase Free ddH2O。
将逆转录的cDNA取出2μl作为模板进行PCR反应
4. PCR反应：
反应成分 | 体积/反应 | 终浓度 |
PCR Master Mix(2×) | 10μl | 1× |
PCR Enzyme Mix | 1μl | |
Forward PCR primer(10μM) | 0.2μl | 0.1μM |
Reverse PCR primer(10μM) | 0.2μl | 0.1μM |
模板cDNA | 2μl | |
RNase Free ddH2O | 补水至30μl |
5.PCR反应循环参数设定：（请参照各类仪器的操作软件进行设置）
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
1 | 反转录反应 | 50℃ | 10分钟 | 1 |
2 | 预变性 | 94℃ | 3分钟 | 1 |
3 | 变性 | 94℃ | 10秒 | 40 |
延伸及检测荧光 | 60℃ | 40秒 | ||
步骤3中进行荧光检测 | ||||
结果检测：反应结束后取10ml反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
注意：实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定最佳反应条件。
注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
